植物可溶性糖含量測試盒微量法

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商品屬性：

測定意義：

糖類物質是構成植物體的重要組成成分之一，也是新陳代謝的主要原料和貯存物質。總糖是指樣品中的還原單糖及在本法測定條件下能水解成還原單糖的蔗糖、麥芽糖和可部分水解為葡萄糖的淀粉。

測定原理：

蒽酮比色法。可用于可溶性單糖、寡糖和多糖的含量測定，具有靈敏度高﹑簡便快捷﹑適用于微量樣品的測定等優點。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、沸水浴、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、濃硫酸（不允許快遞）研缽、和蒸餾水。

試劑的組成和配制:

提取液一：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。

提取液二：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：粉劑×1 瓶，-20℃保存；

試劑二：液體 20mL×1 瓶，4℃保存；

試劑三：液體 14uL×1 支，4℃保存；

組織樣本的前處

①總 GAPDH 酶提取：建議稱取約 0.1g 樣本，加入 1mL 提取液一，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴，200W，破碎 3s，間歇 7s，總時間 1min），然后 4℃，8000g 離心 10min，取上清測定。

②胞漿和葉綠體 GAPDH 酶的分離：按照植物組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5～10的比例（建議稱取約 0.1g 樣本，加入 1mL 提取液一），冰浴勻漿后于 4℃，200g 離心 5min，棄沉淀，取上清4℃，8000g 離心 10min，取上清用于測定胞漿 GAPDH 酶活性，取沉淀加 1mL 提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W，破碎 3s，間歇 7s，總時間 1min），然后 4℃，8000g 離心 10min，取清測定葉綠體中 GAPDH 酶活性。建議測定總 GAPDH 酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測定胞漿和葉綠體中的GAPDH，則按照步驟②提取粗酶液。細菌或培養細胞的前處理先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（104個）：提取液一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟:

1、 分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 340nm，蒸餾水調零。

2、 樣本測定

（1）工作液的配制：將試劑二全部倒入試劑一瓶中，充分溶解，37℃(哺乳動物)或 25℃(其它物種)預熱 10 分鐘；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

（2）在試劑三中加入 500μL 蒸餾水，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

（3）在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 5μL 樣本、5μL 試劑三和 190μL 工作液，混勻，加入最后一個試劑的同時開始計時，記錄 340nm 處 20s 時的吸光值 A1 和 5min20s 后的吸光值 A2，計算 ΔA=A1-A2。

GAPDH 活性計算

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位的定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。GAPDH（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=1286×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每一萬個細菌或細胞每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。GAPDH（nmol/min/104cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500 ×V 樣÷V 樣總) ÷T=2.572×ΔA

V 反總：反應體系總體積，2×10-4L；ε：NADH 摩爾消光系數，6.22×103L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.005 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500 萬。

b.用 96 孔板測定的計算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=2572×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位的定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。GAPDH（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=2572×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每一萬個細菌或細胞每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。GAPDH（nmol/min/104cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500 ×V 樣÷V 樣總) ÷T=5.144×ΔA

V 反總：反應體系總體積，2×10-4L；ε：NADH 摩爾消光系數，6.22×103L / mol /cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.005 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500 萬。

生化試劑盒的使用注意事項：

選擇合適的試劑盒：根據實驗目的和檢測對象選擇合適的試劑盒，確保實驗的準確性和可靠性。

嚴格遵循說明書：按照試劑盒的說明書進行操作，避免誤用或浪費。

注意保存條件：按照試劑盒的保存條件進行妥善保存，避免陽光直射、高溫或潮濕等不利因素。

控制實驗條件：在實驗過程中嚴格控制實驗條件，如溫度、時間、pH值等，以確保實驗結果的穩定性。

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