名稱    大鼠腎足突細胞

2.組織來源：腎組織

3.產品規格：5×105cells/T25細胞培養瓶

4.細胞簡介：

大鼠腎足突細胞分離自腎組織；腎小球是腎元中的用于將血液過濾生成原尿的一團毛細血叢，被鮑氏囊所包裹，是尿液形成的重要構造。血液經由入球小動脈進入腎小球。腎小球內的微血管不像其他微血管，匯流入靜脈，而是流入出球小動脈。在腎小球內，微血管受到高壓，而加速了超濾作用（hyperfiltration）的進行。微血管中的血液經由超濾作用之后，形成濾液，滲入鮑氏囊內。腎小球與鮑氏囊合稱為腎小體，腎小球的過濾速率便稱為腎小球過濾率。足細胞（podocyte）即腎小囊臟層上皮細胞，它附著于腎小球基底膜（GBM）的外側，連同GBM和毛細血管內皮一起構成了腎小球血液濾過屏障。足細胞特殊的解剖位置，使得其體內研究較為困難；又由于正常成年機體的腎臟足細胞是一種終末分化細胞，體外培養的原代細胞不能增殖。足細胞呈星型多突狀，胞體較大，由胞體伸出許多突起，又稱足突（FP），呈指狀交叉復蓋于GBM外表面，并通過黏附分子和蛋白多糖分子與GBM相連。足細胞在正常情況下可以分泌GBM的主要組成成分，IV型膠原和纖維連接蛋白（FN）；在促腎纖維化引資等刺激下還能分泌具有降解GBM作用的基質金屬蛋白酶（MMPs）和組織蛋白酶，從而在GBM的代謝平衡中發揮重要作用。足細胞之間鄰近的足突相互交替，形成了許多30-40nm的裂孔，孔上覆蓋一層厚4-6nm的裂孔隔膜，即腎小球足突間裂孔隔膜。后者是血漿蛋白通過脈管系統的最后屏障，對于維持腎小球濾過屏障結構與功能完整性發揮關鍵作用。

5.方法簡介：

實驗室分離的大鼠腎足突細胞采用機械研磨過不同孔徑不銹鋼網篩結合膠原酶消化法制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

6.質量檢測：

實驗室分離的大鼠腎足突細胞經PCK免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

7.培養信息：

包被條件鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培養基含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

產品貨號CM-R067

換液頻率每2-3天換液一次

生長特性貼壁

細胞形態上皮細胞樣

傳代特性可傳1-2代

消化液0.25%胰蛋白酶

培養條件氣相：空氣，95%；CO2，5%

產品名稱

產品特點:

1、 使用方便:不需昂貴設備。

2、 可以處理各種細菌菌體，包括新鮮菌液和冰凍菌體。

3、 將蛋白提取的時間縮短至30分鐘-1小時。

4、 采用溫和的中性裂解組分，保持蛋白活性。

5、 含蛋白穩定劑，提取的蛋白穩定。

6、 紫外檢測蛋白濃度時，背景干擾低。

7、 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優化。蛋白酶抑制劑混合物包含6種獨立的蛋白酶抑制劑；每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶等。

8、 本試劑盒中不有EDTA，與金屬螯和層析等兼容。

細胞處理：

1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養基的培養瓶中培養過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置于37℃培養箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加少量培養基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補加培養基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。

4.將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。

一、凍存時的注意事項：

1. 在冷凍保存之前，應觀察細胞生長是否良好(log phase) 且存活率高，凍存的細胞密度為80 – 90 ％最佳

2. 冷凍前檢測細胞是否保有其*性質，例如是否有雜細胞或者支原體等。

3. 使用的DMSO 應為試劑級等級，以5~10 ml 小體積分裝，4 度避光保存，勿作多次解凍。使用的甘油也應為試劑級等級，以高壓蒸汽

滅菌后避光保存。在開啟后一年內使用，因長期儲存后對細胞會有毒性。

4. 冷凍保存的細胞濃度：

4-1. 正常的成纖維細胞: 1-3x 10^6 cells/ml

4-2 雜交瘤細胞: 1~3 x 10^6 cells/ml，細胞濃度不要太高，某些雜交瘤會因冷凍濃度太高而在解凍24 小時后。

4-3.貼壁腫瘤細胞: 1 x 10^6，依細胞種類而異。腺癌類的細胞解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 10^6 cells/ml。

4-4. 懸浮細胞: 5~10 x 10^6 cells/ml, 而淋巴類細胞須至少5 x 10^6 cells/ml。

5. 冷凍保護劑濃度為5 %或10 ％ DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應作一個backup culture，以防止冷凍失敗。

收到細胞后，請按照以下方法進行操作。

1. 取出25cm2培養瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5% CO2細胞培養箱中靜置6-8小時或者過夜，以穩定細胞狀態。

2. 待細胞達到80%匯合時準備進行傳代培養。

3. 細胞傳代

1) 吸出25cm2培養瓶中的培養基，用PBS清洗細胞一次；

2) 添加0.125%胰蛋白酶消化液約1mL至培養瓶中，37℃溫浴3min左右；倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后吸棄消化液，再加入*培養液終止消化；

3) 用吸管輕輕吹打混勻，按1:2或1:3等適當的比例進行接種傳代，然后補充新鮮的*培養基至5mL，放入37℃，5% CO2細胞培養箱中培養；

4) 待細胞*貼壁后，培養觀察。之后每隔2-3天更換新鮮的*培養基。